超高效液相色谱法分析不同产区青翘主成分含量
张晓燕¹，谢勇 ²，祝宇¹，余世荣¹，王娇莉²，杜鹏阳³
[1.湖北省十堰市人民医院（湖北医药学院附属人民医院）药学部，十堰 442000；2.武当特色中药研究湖北省重点实验室，十堰 442000；3.兵兵宏康中药饮片（十堰）有限公司，十堰 442000]
摘要 目的 建立超高效液相色谱（UPLC）法分析青翘主成分的含量变化，评价不同产区青翘质量。方法 UPLC法测定18个产区青翘中连翘苷、连翘酯苷A、芦丁含量，对其重要程度按层次分析法（AHP）法进行重要性评判，计算每种成分权重，根据权重计算每个样品综合评分，一测多评评价各产地青翘综合质量。结果 湖北省十堰市郧阳区5批青翘样品综合评分平均89.4，普遍高于其他产区。结论 湖北省十堰市是野生青翘药材传统产区，规范采收时间及产地加工工艺能保证该地区青翘药材质量优质及均一。
关键词 青翘；连翘苷；连翘酯苷A；超高效液相色谱法
中图分类号 R286；R927.1 文献标识码 A 文章编号 1004-0781（2020）03-
青翘是木犀科连翘属连翘Forsythia suspensa ( Thunb.)Vahl的果实在秋季初熟尚带绿色时采收，除去杂质，蒸熟，晒干的药材^[1-2]。青翘药材以野生为主，主产于陕西、山东、安徽、河北、山西、河南、湖北等地^[3]。但长期以来各产区野生青翘一直处于自由采收，采青、抢青现象突出，缺乏有效管控的状态，导致不同产地青翘外观性状及有效成分含量等方面存在差异，各产区药材质量良莠不齐。青翘主要含有连翘酯苷A、连翘酯苷B、连翘苷、连翘酯素、芦丁、右旋松脂酚等化学成分^[4]，是发挥抗菌、抗炎、解热、镇吐、镇痛、抗病毒、抗氧化生理活性的物质基础。笔者在本实验参考王姝君等^[5-8]连翘活性成分含量测定方法，采用超高效液相色谱（UPLC）法建立青翘中连翘苷、连翘酯苷A 及芦丁一测多评含量测定方法，采用层次分析法（analytic hierarchy process，AHP）对3种成分权重进行积分，综合评价不同产地青翘质量差异。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Waters Acquity 超高效液相色谱仪(美国Waters 公司，包含四元泵、柱温箱、自动进样器、PDA 检测器、Empower 工作站) ；电子分析天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司，感量：0.01 mg]，H1650-W微量台式高速离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司），2013QT超声仪（超声波清洗机）、药筛等。
1.2 药物与试剂 连翘苷、连翘酯苷A、芦丁（四川省维克奇生物科技有限公司，批号分别为wkq18012210、wkq16060102、wkq18012501，含量均为98%）；乙腈、甲醇为色谱纯；水为双重蒸馏水；其他试剂均为分析纯。18批青翘药材采自山西、陕西、河南、湖北等地，经湖北中医药大学陈科力教授鉴定均为正品。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 ACQUITYULCRBEH C₁₈色谱柱 ( 2.1 mm ×100 mm，1.7 μm)；流动相乙腈 (A)-0.2% 甲酸水 (B)，梯度洗脱 ( 0～15 min，10%～30%A)；检测波长277，330 nm；体积流量 0.3 mL·min^-1；柱温 35 ℃；进样量 1 μL。色谱图见图 1。
















A.连翘苷对照品；B.连翘脂苷A对照品；C.芦丁对照品；D.青翘样品
图1 青翘UPLC图谱
A.The standard solution of phillyrin；B.The standard solution of forsythiaside A；C.The standard solution of rutin；D.The sample of green fructus forsythiae
Fig. 1 UPLC chromatograms of green fructus forsythiae
2.2 对照品溶液的制备 取连翘苷、连翘酯苷A、芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制成0.28，0.21，0.21 mg·mL^-1溶液，摇匀，低温、避光储存备用。
2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末（过3号筛，50目，筛孔内径：180μm±7.6μm）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶，精密加入70%甲醇15 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)40 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.4 线性关系考察 精密吸取“2.2”项各对照品溶液，制成连翘苷浓度为93 μg·mL^-1、连翘酯苷A浓度为70 μg·mL^-1、芦丁浓度为70 μg·mL^-1的混合对照品溶液，按“2.1”项色谱条件分别进样0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 μL，测定各峰面积。以进样量（μL）为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得回归方程，见表1，连翘苷在0.28〜4.48 mg·mL^-1范围内线性关系良好。
表1 连翘苷、连翘酯苷A、芦丁回归方程
Tab. 1 The linear relationship of phillyrin， forsythiaside A and rutin

测定成分	回归方程	R	线性范围/μg
连翘苷	y = 207543x - 521.96	1	0.0093~0.2976
连翘酯苷A	y = 429304x - 1611.2	1	0.0070~0.224
芦丁	y = 298262x - 3089.4	0.9999	0.0070~0.224

2.5 精密度实验 取混合对照品溶液，按“2.1”项色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算得连翘苷色谱峰RSD =1.58%（n=6），连翘酯苷A色谱峰RSD =1.87%（n=6），芦丁色谱峰RSD=1.74%（n=6），表明该仪器精密度良好。
2.6 重复性实验 取6份同一样品各约0.5 g，精密称定，按“2.3”项制备方法制备供试品，按“2.1”项色谱条件进样，记录色谱峰面积并计算RSD值。结果得连翘苷RSD=1.56%（n=6），连翘酯苷ARSD=0.92%（n=6），芦丁RSD=2.48%（n=6），表明该方法重复性良好。
2.7 稳定性实验 取同一供试品，按“2.3”项色谱条件分别于0，1，2，4，6，8，12 h进样，记录峰面积并计算RSD值，结果得连翘苷RSD=2.18%（n=6），连翘酯苷ARSD=0.87%（n=6），芦丁RSD=0.80%（n=6），表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。
2.8 加样回收率实验 取已知含量连翘粉末约0.25 g，共6份，精密称定，置15 mL锥形瓶，分别精密加入连翘苷对照品3.650 mg，连翘酯苷A19.500 mg，芦丁对照品2.680 mg，再加稀乙醇定容，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样1 μL。计算加样回收率。结果见表2。
表2 连翘苷、连翘酯苷A、芦丁加样回收率
Tab.2 The average recovery rate of phillyrin，forsythiaside A and rutin

测定 成分	取样量 /mg	样品含量/mg	加入量 /mg	测得量 /mg	回收率 %	RSD %
连翘苷	260.50	3.657	3.650	7.197	96.993	1.23
	254.75	3.646	3.650	7.286	99.726
	256.50	3.671	3.650	7.231	97.533
	256.25	3.667	3.650	7.271	98.727
	254.00	3.635	3.650	7.268	99.527
	257.50	3.650	3.650	7.295	99.874
连翘酯苷A	260.50	19.552	19.500	38.925	99.351	0.35
	254.75	19.494	19.500	38.874	99.384
	256.50	19.628	19.500	38.908	98.872
	256.25	19.609	19.500	38.966	99.267
	254.00	19.437	19.500	38.901	99.817
	257.50	19.513	19.500	38.963	99.742
芦丁	260.50	2.686	2.680	5.263	96.158	1.82
	254.75	2.678	2.680	5.328	98.877
	256.5	2.696	2.680	5.264	95.803
	256.25	2.694	2.680	5.247	95.266
	254.00	2.670	2.680	5.299	98.089
	257.5	2.681	2.680	5.348	99.525

2.9 样品的含量测定及质量评价 取分布于湖北、河南、山西、陕西四省18个野生青翘主产地的样品，其中湖北产区样品由本项目组于8月底采样，并按项目组研究的产地加工方法规范加工，其他产区于9月底委托连翘产地药商购于当地。18个样品统一按“2.3”项制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件分别进样测定，测得18批样品中连翘苷、连翘酯苷A、芦丁各成分含量见表3。并采用AHP法进行积分，先对连翘各产地质量评价的决策建立层次结构模型，采用1～9 标度法对连翘苷、连翘酯苷A、芦丁3 项指标进行两两比较，按9分位比率评判各评价指标相对重要顺序，列举各评价指标的判断优先矩阵。再按几何平均法（根法）计算各指标的权重系数，得到连翘苷、连翘酯苷A、芦丁的权重系数分别为0.41，0.41，0.18。对求得的各个权重系数进行一致性检验，得到CI_{（一致性指标）}＝0，CR_{（随机一致性比率）}＝0（＜0.1），说明评价指标层的判断矩阵和单排序结果通过了一致性检验，所求得的权重系数有效，确定各有效成分的权重，再根据权重计算各样品的综合评分，结果见表3。
表3 各产地青翘中3种成分含量及质量综合评价
Tab.3 Content and quality evaluation of three ingredients in green fructus forsythiae
in different regions

序号	产 地	连翘苷 %	连翘酯苷A %	芦丁 %	综合 评分
1	湖北省十堰市郧阳区①	1.44	7.21	0.99	95.55
2	湖北省十堰市郧阳区②	1.23	7.59	1.12	93.70
3	湖北省十堰市郧阳区③	1.11	7.33	0.68	81.82
4	湖北省十堰市郧阳区④	0.92	6.93	0.86	77.16
5	湖北省十堰市郧阳区⑤	1.43	7.65	1.05	98.59
6	湖北省十堰市房县①	0.87	6.12	0.45	64.80
7	湖北省十堰市房县②	1.26	5.94	0.99	83.62
8	湖北省十堰市房县③	1.21	6.98	0.73	83.59
9	湖北省十堰市郧西县①	1.41	4.50	0.66	74.87
10	湖北省十堰市郧西县②	0.92	2.30	0.44	59.07
11	湖北省十堰市丹江口市	1.17	6.81	0.94	84.92
12	湖北省十堰市张湾区	1.08	6.83	0.94	82.46
13	湖北省十堰市竹山县	0.90	6.34	0.70	70.85
14	陕西商洛市丹凤县	0.63	4.99	0.60	54.32
15	河南洛阳市嵩县	0.61	3.27	0.40	41.32
16	河南三门峡市卢氏县	0.69	3.38	0.45	44.99
17	河南安阳市林州市	0.88	6.20	0.77	70.66
18	山西临汾市襄汾县	0.49	3.35	0.39	38.17

综合评分K _i＝各样品连翘苷含量/连翘苷最高含量×0.41×100＋各样品连翘酯苷A含量/连翘酯苷A最高含量×0.41×100＋各样品芦丁含量/芦丁最高含量×0.18×100，i＝1，2，3，⋯⋯，18.
3 讨论
3.1 UPLC法测定连翘苷、连翘酯苷A、芦丁含量方法的优化 《中华人民共和国药典》2015年版连翘的含量测定项下连翘苷及连翘酯苷A的供试品溶液需分开制备，连翘苷供试品溶液制备需经过静置过夜、提取、蒸干、过氧化铝柱、洗脱、浓缩至干、定容等步骤，测定两种成分处理供试品往往需要>3 d，耗时长，过程繁琐，样品回收率低。本实验经过反复实验发现以70%甲醇超声提取40 min 时，采用 UPLC 结合梯度洗脱，用一个色谱条件同时检测3种成分，在检测波长277，330 nm时分别读取连翘苷、连翘酯苷A、芦丁的数据计算含量，简化了供试品制备步骤，有效提高了分析速度，提高了实验方法精密度及重复性，并且通过实验方法验证该方法测定连翘苷、连翘酯苷A的含量与《中华人民共和国药典》2015年版方法比较接近，因此该方法用于平行评价不同产地青翘的质量可行，同时为简便快捷、有效地监控青翘质量提供一种新检测方法。
3.2 各产区青翘质量综合评价 青翘是大宗清热解毒类中药材^[9]。笔者在本实验中选择《中华人民共和国药典》2015年版连翘鉴别项连翘苷和连翘酯苷A含量及黄酮类成分芦丁作为质量评价指标。对3种成分重要程度按AHP法进行重要性评判，按各成分权重计算每个样品的综合评分，用综合评分来一测多评评价各产地青翘的综合质量。从实验结果来看，不同产区青翘药材中主要成分含量有一定差异性。湖北省十堰市郧阳区5批青翘样品综合评分平均达89.4分，普遍高于其他产区，尤其是连翘酯苷A含量高于其他产区。十堰市房县产区①号样采自30年树龄老树，连翘苷含量较低，是否与树龄有关，有待项目组后期进一步研究。郧西县2批样品中连翘酯苷A含量低于郧阳区很多，是否与地理环境、气候条件有关也有待后期进一步研究。其他山西、陕西、河南产区综合评分低于湖北省十堰市，可能与产地加工不规范，不能与项目组于湖北十堰市产区同步平行采收时间及加工方法有关。从本实验结果可以看出，湖北十堰产区青翘综合质量优于其他产区，可能与该区一直是野生连翘药材传统产区，采收野生青翘一直是当地药农主要创收手段有关^[10]。假如当地重视规范采收时间及产地加工工艺，就能保证该地区出产的道地野生青翘质量优质及均一，彰显该道地药材的道地性，为促进当地特色农业发展添砖加瓦，为当地农民持续增收提供保障。
参考文献
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